Recientemente se publicó la primera descripción de una FAD-AMP liasa oFMN ciclasa, una preparación parcialmente purificada a partir de higadode rata (Fraiz FJ,Pinto RM, Costas MJ, Avalos M, Canales J, Cabezas A,Cameselle JC, Biochem. J. 330,881-888,1998). El principal objetivo de estatesis doctoral era purificar esta FMN ciclasa hasta un grado de homogeneidadaparente y emplear la preparacion de alta pureza para confirmar y ampliarla caracterización de la enzima parcialmente purificada. Los pasos de purificacionfueron: obtención de un sobrenadante de 100000 g a partir de homogeneizadosde higado de rata en medio isotónico, precipitación fraccionada con sulfatoamónico, cromatografias de filtración en gel, intercambio ionico, afinidadpor Verde Reactivo 19-agarosa y afinidad por ADP-agarosa. La adsorcióna ADP-agarosa se consiguió en presencia de Mn2+ (cation activador de laenzima), condición en que la FMN ciclasa permanecia adherida incluso aalta fuerza iónica, recuperandose con baja fuerza iónica sin Mn2+. Losresultados de la purificación completa fueron: actividad especifica, 2,2U/mg,purificación de 240 veces y rendimiento del 15%. Por electroforesisen condiciones desnaturalizantes revelada con plata, solo se observó unabanda proteica de 59 kDa. La correspondencia de la proteina con la actividadFMN ciclasa se puso de manifiesto por electroforesis desnaturalizante seguidade renaturalización, ultracentrifugación en gradiente seguida de analisispor electroforesis desnaturalizante, y electroforesis no desnaturalizantecon revelado de la actividad FMN ciclasa por fluorescencia. La masa molecularnativa de la FMN ciclasa resultó ser 100 Kda ó 140 Kda al medirla por ultracentrifugaciónen gradiente o por cromatografia de filtracion en gel, respectivamente.Los estudios de especificidad de sustrato y reaccion indicaron que la enzimatiene actividad liasa(ciclante) sobre los siguientes sustratos: FAD(mejorsust
