En la actualidad, una de las técnicas más usadas en la tecnología de la reproducción porcina es la inseminación artificial con semen refrigerado. Para que los espermatozoides conserven su capacidad fecundante durante varios días, los eyaculados son diluidos con diluyentes comerciales, de corta y larga duración, para producir dosis seminales que serán posteriormente conservadas a 15-17ºC hasta el día de su uso, normalmente en un periodo inferior a 5 días. Es precisamente el diluyente uno de los factores que influyen en la tolerancia de los espermatozoides a la conservación mediante refrigeración. La diferencia entre los diluyentes deriva de su composición; esta diferencia hace que unos diluyentes conserven mejor el semen porcino que otros, como así se ha demostrado en numerosos estudios. Sin embargo, hay muy pocas referencias bibliográficas con respecto al papel de la raza del macho en la tolerancia de los espermatozoides a la conservación en un diluyente determinado. Es por ello que en la presente tesis doctoral nos propusimos estudiar la capacidad de conservación de dosis seminales de dos diluyentes de amplio uso, MRA y X-Cell, teniendo en cuenta la raza como posible fuente de variación. De nuestro estudio podemos concluir que cada raza se adapta de manera diferente a los distintos diluyentes en términos de comportamiento de la motilidad objetiva durante el periodo de conservación; además, para un mismo diluyente también se observaron diferencias en función de la raza en estudio. Así, y como resultados a destacar, en términos de mayor motilidad progresiva podríamos decir que el diluyente más indicado para la raza Ibérica sería el X-Cell y que la magnitud de las diferencias entre razas puede variar en función del diluyente utilizado. Por lo tanto, y en virtud de la variabilidad observada entre diluyentes para una raza concreta, podemos recomendar que los estudios que se planteen comparar la eficacia de varias diluyentes durante la conservación lo hagan para una raza en concreto.Es conocido que las dosis seminales van perdiendo con el tiempo la capacidad fecundante cuando son conservadas a 17ºC. Esta disminución de la capacidad fecundante podría estar asociada a la composición lipídica de la membrana del espermatozoide de cerdo, que contiene una gran cantidad de ácidos grasos poliinsaturados, lo que los hace muy susceptibles a la oxidación; es por ello que se han añadido distintas sustancias antioxidantes a las dosis seminales para mejorar esta menor calidad espermática. Por este motivo en la presente tesis doctoral nos propusimos usar dos antioxidantes: melatonina (1 µM) y resveratrol (10, 33, 66 y 100 µM), en función de los resultados favorables obtenidos en la conservación de espermatozoides de otras especies. Sin embargo, nuestros resultados en la especie porcina no nos permiten aconsejar el uso de estos dos antioxidantes para mejorar la conservación de dosis seminales durante 7 días a 17ºC al haberse observado, tras la adición de melatonina, una disminución del porcentaje de espermatozoides mótiles y, especialmente el día 7 de conservación, una disminución de la viabilidad y de la velocidad de los espermatozoides. Con el uso del resveratrol se observa una disminución del porcentaje de espermatozoides mótiles y de sus velocidades en dosis seminales porcinas. Además, el resveratrol tiene un claro efecto deletéreo en el metabolismo del espermatozoide al disminuir el potencial de membrana mitocondrial y disminuir el contenido de ATP de estas células. Finalmente, entre los efectos negativos del resveratrol también debemos destacar la desorganización de las membranas plasmática y acrosomal, la disminución de la respuesta específica al bicarbonato y el aumento de la respuesta específica al calcio (asociado a una pérdida de la homeostasis del calcio) que se produce el día 7 de conservación de las dosis seminales a 17ºC.Una alternativa que consideramos para la mejora de la conservación de los espermatozoides es profundizar en el estudio de la fisiología espermática, en concreto en lo referente a las rutas de señalización intracelular. En este sentido, recientemente nuestro grupo de investigación ha descrito por primera vez la presencia de la proteína AMPK en células germinales masculinas de mamíferos y ha demostrado la importancia de esta proteína tanto en la movilidad, como en el mantenimiento de la organización de las membranas plasmáticas y acrosomal de los espermatozoides porcinos. En la presente tesis doctoral hemos descrito por primera vez que la fosforilación (activación) de la AMPK en el residuo treonina 172 (PThr172-AMPK), se incrementa en función del tiempo de conservación de los espermatozoides porcinos a 17ºC, alcanzando un máximo de actividad el día 7. Este aumento de la actividad podría estar relacionado con la respuesta metabólica del espermatozoide para prevenir situaciones de estrés por enfriamiento. Además, una vez descrito que esta proteína se expresa en espermatozoides porcinos, usamos un inhibidor específico de la proteína AMPK, el compuesto C, obteniendo como resultado una menor estabilidad de la membrana plasmática y un descenso de la motilidad espermática. Estos resultados indican que un correcto funcionamiento de la proteína AMPK es necesario para el mantenimiento de la calidad de las dosis seminales conservadas a 17ºC a largo plazo.
