El espermatozoide es una célula germinal altamente especializada que debe experimentar unos procesos funcionales característicos, como son la movilidad, hiperactivación, capacitación o la reacción acrosómica, para lograr su función primordial: la fecundación del ovocito. Estos procesos funcionales son por un lado dependientes del estado energético de esta célula germinal, que está determinado, al igual que en células somáticas, por la relación entre los niveles celulares de AMP, ADP y ATP (Ford, 2006; Miki, 2007), y por otro están regulados por mecanismos bioquímicos, entre los que destaca la fosforilación de proteínas. La célula germinal masculina posee una elaborada compartimentación celular que provoca que, en la última fase de su desarrollo, no pueda llevar a cabo ni la transcripción ni la traducción y, consecuentemente, es incapaz de sintetizar proteínas. Por todo ello, las rutas de señalización intracelular que regulan los procesos celulares basadas en las modificaciones postraduccionales de las proteínas pre-existentes, como la fosforilación de proteínas, catalizada por enzimas quinasas, son especialmente relevantes en esta célula germinal.La proteína quinasa activada por AMP, AMPK, es una Ser/Thr quinasa muy conservada desde el punto de vista evolutivo, que actúa como una molécula sensora de la carga energética celular, y cuya activación provoca una regulación del metabolismo (Hardie y cols., 2006). Estructuralmente es una proteína heterotrimérica que posee una subunidad catalítica ¿ y dos subunidades reguladoras ¿ y ¿. Una de las características esenciales de la AMPK es su extremada sensibilidad a su efector alostérico AMP, ya que cualquier aumento en el ratio AMP/ATP (que indica un descenso de la carga energética celular), provoca la activación de la AMPK (Hardie y cols., 2006; Long y Zierath, 2006). De forma adicional a su activación alostérica por AMP, la fosforilación en el residuo de Thr172 localizado en el bucle de activación de su subunidad catalítica ¿, es necesaria para lograr la actividad máxima de la AMPK (Carling, 2004). Se han descrito varias quinasas que fosforilan dicho residuo en la AMPK: i) LKB1, que está codificada por un gen supresor de tumores y responsable del síndrome Peutz-Jerhers, ii) dos isoformas, ¿ y ß, de CaMKK, que es la quinasa de la quinasa dependiente de calcio y calmodulina, iii) TAK1, que es la proteína quinasa activada por TGFß y iv) la quinasa KSR2. Diversos tipos de estrés celular y metabólico también provocan la activación de AMPK (Hardie y cols., 2006; Long y Zierath, 2006). En cualquier caso, la actividad de AMPK regula el metabolismo al provocar la estimulación de vías catabólicas que producen ATP y la inhibición de las rutas anabólicas que consumen ATP, de tal forma que la consecuencia metabólica es el mantenimiento de los niveles de ATP en condiciones en las que éstos se encuentran comprometidos.Hasta el momento de plantear esta Tesis Doctoral, todas las investigaciones sobre AMPK se habían realizado en células somáticas, aunque sí existían dos trabajos que indicaban que quinasas relacionadas con la AMPK desempeñaban una función en los espermatozoides de mamíferos. Así, en 2008 se había descrito que una nueva isoforma (corta) de la quinasa que fosforila AMPK, LKB1s, y se expresa predominantemente en células espermátidas de mamíferos (Towler y cols., 2008), tiene un papel esencial en la espermiogénesis y en la capacidad fecundante en ratones. Paralelamente, se demostró que la deleción de TSSK1 y TSSK2, miembros de la familia TSSK de Ser/Thr quinasas específicas de testículos, y que pertenecen a la rama de la AMPK en el árbol del quinoma humano, provoca infertilidad en ratones (Xu y cols., 2008). Por todo ello, en la presente Tesis Doctoral nos planteamos la hipótesis de que la AMPK podría desempeñar un papel clave en la célula germinal masculina de mamíferos, probablemente en aquellos procesos celulares muy dependientes del estado energético celular, que a su vez son esenciales para que el espermatozoide consiga fecundar al óvulo. Según esta hipótesis, nos planteamos los siguientes objetivos en la presente tesis Doctoral: 1- Estudiar la expresión y localización celular de la proteína AMPK y de su forma activa en la célula germinal masculina de cerdo. 2- Estudiar, en el espermatozoide de cerdo, la regulación de la actividad de la AMPK en diferentes condiciones extracelulares y las vías de señalización intracelular implicadas. 3- Estudiar el posible papel de la proteína AMPK en diferentes parámetros y procesos funcionales del espermatozoide que lo capacitan para llevar a cabo la fecundación: movilidad, viabilidad, organización lipídica de la membrana plasmática, integridad de la membrana externa del acrosoma, así como el potencial de membrana mitocondrial. Los resultados de la presente Tesis Doctoral nos permiten elaborar las siguientes conclusiones: 1- La proteína quinasa activada por AMP, AMPK, se expresa en el espermatozoide de cerdo y se encuentra enzimáticamente activa en condiciones fisiológicas. 2- La proteína AMPK se localiza principalmente en todo el acrosoma y en la pieza intermedia del flagelo del espermatozoide de cerdo. Cuando está activa, su localización en la pieza intermedia del flagelo se mantiene, sin embargo, en la cabeza del espermatozoide su localización está restringida a la parte más apical del acrosoma. 3- La ruta de señalización que provoca la activación de AMPK por fosforilación en el espermatozoide de cerdo está regulada por mensajeros intracelulares como el calcio y el cAMP, así como por la proteína quinasa A (PKA), proteína quinasa C (PKC) y las proteínas quinasas ¿ y/o ß de la quinasa dependiente de calcio y calmodulina (CaMKK¿/ß). 4- La proteína AMPK está involucrada en la regulación de la movilidad del espermatozoide de cerdo. Es importante mencionar que, de forma paralela a la publicación de los resultados que sustentan esta conclusión, Tartarin y cols., (2012) han demostrado en ratones knockout para AMPK¿1 que la AMPK está implicada en la movilidad de la célula germinal masculina. Por ello, esta cuarta conclusión se ve apoyada por otro estudio, utilizando una aproximación experimental diferente en otra especie de mamífero, y contribuye a reforzar la idea de que la AMPK es esencial para una correcta movilidad. 5- La proteína AMPK desempeña una importante función en las membranas del espermatozoide de cerdo. Por un lado, está implicada en el mantenimiento de la integridad de la membrana externa del acrosoma y, por otro, contribuye tanto al mantenimiento de la organización lipídica de la membrana plasmática, como al control de la translocación de la fosfatidilserina hacia su cara externa. 6- La proteína quinasa AMPK está implicada en la regulación del potencial de membrana mitocondrial del espermatozoide de cerdo. 7- La proteína quinasa AMPK se activa por fosforilación en el espermatozoide de cerdo en repuesta a determinados tipos de estrés celular. En resumen, consideramos que los resultados que aporta esta Tesis Doctoral permiten proponer a la AMPK como una quinasa esencial que regula la capacidad de la célula germinal masculina para adaptarse a las fluctuantes condiciones externas, como ocurre durante el tránsito a través del tracto reproductor femenino.
