Las condiciones ecológicas alcanzadas durante el proceso de secado/maduración de los derivados cárnicos curado-madurados favorecen el crecimiento de una población de mohos en su superficie. La mayoría de ellos, afectan de forma positiva a las características sensoriales del producto final; sin embargo, algunos son capaces de producir micotoxinas y otros metabolitos secundarios tóxicos. Entre las micotoxinas que se pueden encontrar en estos productos, las más frecuentemente aisladas son aflatoxinas (AFs), ácido ciclopiazónico (ACP) y ocratoxina A (OTA). Las micotoxinas son compuestos que, en pequeñas cantidades, pueden ocasionar patologías relacionadas con efectos nefrotóxicos, inmunotóxicos, hepatotóxicos, genotóxicos, carcinogénicos, mutagénicos y teratogénicos, pudiendo afectar gravemente la salud del consumidor. Algunas de estas micotoxinas, además de ser estables y difíciles de eliminar, son capaces de difundir al interior del alimento, agravando el problema de seguridad alimentaria relacionado con la presencia de micotoxinas en los derivados cárnicos curado-madurados, por lo que resulta especialmente preocupante el crecimiento incontrolado de mohos en la superficie de estos productos cárnicos. Entre las estrategias que pueden utilizarse para minimizar la presencia de mohos toxigénicos, aquellas relacionadas con el estudio de la influencia de las condiciones del procesado de los derivados cárnicos curado-madurados sobre el crecimiento de los mohos toxigénicos y la producción de micotoxinas, así como aquellas que implican la utilización de microorganismos autóctonos naturalmente adaptados a estos nichos, parecen las más interesantes y prometedoras.Los objetivos de esta Tesis Doctoral consistieron en: a) evaluar la capacidad de difusión de micotoxinas en los derivados cárnicos curado-madurados; b) optimizar un protocolo de extracción y análisis de ACP para la detección y cuantificación de esta toxina en derivados cárnicos curado-madurados; c) evaluar la influencia de los factores ambientales (temperatura y aw) alcanzados durante el proceso de maduración de los productos cárnicos y de microorganismos autóctonos en el crecimiento de mohos toxigénicos, la expresión de los genes relacionados con la biosíntesis de micotoxinas y su producción en modelos elaborados a partir de derivados cárnicos curado-madurados y, d) desarrollar modelos matemáticos para predecir la concentración de AFs y el inicio de su producción en condiciones similares a las alcanzadas durante el proceso de maduración de los derivados cárnicos curado-madurados.En el estudio de la capacidad de difusión de las micotoxinas y otros metabolitos secundarios tóxicos, se validó en primer lugar un método de HPLC-MS/MS para la detección y cuantificación de estos compuestos en derivados cárnicos curado-madurados. En este ensayo, se confirmó que en la mayoría de los casos los metabolitos secundarios eran capaces de difundir hasta 3 cm de profundidad tanto en jamón curado como en salchichón. Previamente al estudio de la influencia de las condiciones ambientales sobre el desarrollo de mohos toxigénicos en derivados cárnicos curado-madurados, se optimizaron en el caso de ACP por su naturaleza inestable, métodos de extracción y de detección de la toxina a partir de estas matrices cárnicas, debido a que los métodos existentes no tenían una buena recuperación ni sensibilidad. Para tal fin, se evaluaron cuatro protocolos de extracción, siendo el más rápido, económico y eficiente el método 4 basado en la metodología QuEChERS obteniéndose recuperaciones superiores al 90%. En el caso de la optimización del método analítico, se evaluó la composición y gradiente de la fase móvil, la velocidad de flujo y el solvente utilizado para la resuspensión de la micotoxina antes de su determinación mediante el método de uHPLC-MS/MS. La mejor resolución del pico cromatográfico se obtuvo con la fase móvil que contenía como fase acuosa acetato de amonio acidificado con ácido acético a pH 5,75 y como fase orgánica metanol a una velocidad de flujo de 0,2 mL/min. Las mejores condiciones del modo de gradiente consistieron en un incremento del metanol hasta el 60% y en un tiempo de gradiente de 11 min para que el metanol alcanzase el 95%. Por último, en el caso de la resuspensión de las muestras, éstas se disolvieron en una solución de ácido acético-acetato de amonio pH 5,75/metanol 30/70 (v/v). Los métodos de extracción y análisis optimizados permiten la detección y cuantificación sensible y rápida de ACP para su análisis en jamón curado, minimizando el tratamiento de la muestra, evitando los efectos de la matriz, reduciendo el tiempo de análisis y el consumo y los costes de los disolventes utilizados.Una de las estrategias utilizadas en esta Tesis Doctoral para minimizar el desarrollo de mohos toxigénicos en la superficie de los derivados cárnicos curado-madurados consistió en evaluar el efecto de diferentes aw (0,95, 0,90 y 0,85) y temperaturas (25, 20, 15 y 10 ºC) que se alcanzan durante el proceso de maduración de estos productos cárnicos, sobre el crecimiento, la expresión relativa de los genes implicados en las rutas biosintéticas del ACP y las AFs y la producción de estas toxinas en medios elaborados con carne y jamón curado. En general, las condiciones óptimas de crecimiento y producción de ACP y AFs de las cepas toxigénicas fueron a una aw de 0,95 y 25 ºC y las condiciones marginales fueron a una aw de 0,90 y 25 ºC y a una aw de 0,85 y 15 ºC respectivamente. Además la expresión relativa de los genes dmaT, pks-nrps y mfs-1 de las cepas de P. griseofulvum y los genes aflR y aflS de las cepas de A. flavus y A. parasiticus estuvieron relacionados con la producción de ACP y AFs, respectivamente. Por lo tanto, el crecimiento de mohos toxigénicos durante la maduración de los derivados cárnicos curado-madurados podría suponer un riesgo importante asociado con la presencia de ACP y AFs, por ello, las condiciones óptimas y marginales para el crecimiento y la producción de ACP y AFs pueden usarse para ayudar en la toma de decisiones en relación con la temperatura y aw durante la maduración de los derivados cárnicos curado-madurados para minimizar la acumulación de ACP y AFs en estos productos. Posteriormente al estudio de la influencia de los parámetros ambientales sobre el crecimiento de mohos toxigénicos y la producción de las toxinas, en el caso de las AFs, se utilizaron los datos obtenidos para diseñar modelos matemáticos de predicción de la concentración de AFs y el momento en que se inicia su síntesis. Para ello, se aplicaron dos técnicas predictivas de minería de datos, lineal (MRL) y no lineal (RI), siendo mejor el rendimiento en el caso del modelo lineal con coeficientes de correlación superiores a 0,76 y 0,88, dependiendo del objetivo de la ecuación de predicción. Este tipo de herramienta puede ser de una gran utilidad para predecir la contaminación de AFs en derivados cárnicos curado-madurados. Finalmente, se evaluó otra estrategia para controlar la contaminación ocasionada por la presencia de mohos toxigénicos en jamón curado y salchichón consistente en la utilización de microorganismos autóctonos como D. hansenii FHSCC 253H y P. chrysogenum CECT 20922 productor de la proteína antifúngica PgAFP. En primer lugar, se evaluó el efecto de la levadura frente a mohos productores de OTA y AFs, en medios elaborados con salchichón y carne y, en los propios productos cárnicos. En los dos casos, la levadura ejerció una inhibición significativa tanto en la expresión de genes asociados con la biosíntesis de las micotoxinas como en la producción de las toxinas. A continuación, se analizó el efecto de un cultivo protector mixto compuesto por ambos microorganismos frente al desarrollo de dos cepas productoras de ACP, comprobando que redujo significativamente la concentración de ACP de ambas cepas cuando se inocularon conjuntamente con el cultivo protector en jamón curado. Los mecanismos de acción de los agentes de biocontrol fueron muy variados dependiendo del microorganismo utilizado o de la cepa de moho toxigénica empleada. En algunos casos inhibieron la expresión de genes implicados en la ruta biosintética y en otros se observó una alta actividad del gen que codifica para la proteína antifúngica PgAFP.El importante riesgo de contaminación de los derivados cárnicos curado-madurados con micotoxinas y otros metabolitos secundarios debido al desarrollo de los mohos toxigénicos en la superficie de estos productos durante el proceso de maduración, justifica la búsqueda de estrategias para controlar el crecimiento de mohos indeseables en estos productos. El control de los factores ambientales, así como la utilización de microorganismos autóctonos como agentes de biocontrol pueden utilizarse como estrategias que limiten el desarrollo de los mohos toxigénicos y, sobre todo, la producción de micotoxinas. Además, la utilización de modelos matemáticos que permitan predecir la producción de micotoxinas es esencialpara mejorar la calidad microbiológica y la inocuidad de los alimentos.
