RESUMEN DE LA TESIS DOCTORAL DE D./Dª GUADALUPE CUMPLIDO LASOEl resumen de la tesis para la base de datos Teseo debe ser una presentación de la tesis y tener la extensión suficiente para que quede explicado el argumento de la tesis doctoral. El formato debe facilitar la lectura y comprensión del texto a los usuarios que accedan a Teseo, debiendo diferenciarse las siguientes partes de la tesis:1. Introducción o motivación de la tesisLa fresa es un fruto de tipo baya perteneciente al género Fragaria, el cual se encuentra incluido dentro de la familia Rosaceae (Mabberley, 2002; Eriksson et al., 2003). La variedad octoploide Fragaria x ananassa es el resultado del cruzamiento entre dos especies nativas americanas, F. chiloensis y F. virginiana y forma parte regular de la dieta de millones de personas en diferentes regiones del mundo (Hancock, 1999). La planta de fresa presenta gran interés agronómico aunque su vida media de post-cosecha es relativamente corta. Con una producción media de 295000 Tm anuales, obtenidas en una superficie de aproximadamente 7500 Ha, España representa el primer productor de fresas frescas de Europa, y el segundo del mundo tras Estados Unidos (FAOSTAT, 2005). El 95% de esta producción se sitúa en la provincia de Huelva (Freshuelva, 2005). No obstante, se estima que entre el 5 y el 25% de la producción, dependiendo de la variedad, se pierde debido al reblandecimiento que sufre el fruto a lo largo de su maduración, a la infección por diferentes patógenos y a otros factores que afectan a la calidad del fruto (López-Aranda, 1997).La fresa posee una estructura de fruto múltiple constituido por un receptáculo carnoso, en cuyo exterior se encuentran los aquenios o verdaderos frutos, embebidos en la capa epidérmica del receptáculo (Erendorfer, 1983). Los aquenios están conectados con el interior del receptáculo mediante haces fibrovasculares a través de los cuales se intercambian nutrientes y hormonas como las auxinas. Las auxinas se sintetizan en los aquenios en desarrollo y se translocan por el floema hasta el receptáculo contribuyendo al desarrollo del mismo (Darrow, 1966).Tras la caída de los pétalos de la flor comienza el desarrollo del fruto que se produce en dos fases claramente diferenciadas (Nitsch, 1950; Hancock, 1999). En primer lugar se produce un crecimiento del receptáculo debido, fundamentalmente, a la división y expansión celular, ambos procesos directamente determinados por el número y distribución de los aquenios en el receptáculo (Hancock, 1999). Posteriormente, se produce la fase de maduración durante la cual el fruto cambia su coloración y modifica sus características organolépticas debido a la biosíntesis de nuevos compuestos y a la degradación de la pared celular lo que conduce al reblandecimiento del fruto (Neal, 1965; Hancock, 1999). En general, la maduración se completa 30-40 días después de la antesis dependiendo de la temperatura ambiental (Dennis, 1984).La fresa se considera un fruto no-climatérico en base a la ausencia de un aumento de su respiración durante su fase de maduración, así como por la ausencia de un incremento significativo en la producción de etileno durante esta fase (Villareal et al., 2009). Sin embargo, se ha propuesto que la pequeña cantidad de etileno producida durante el proceso de maduración de la fresa podría ser suficiente para desencadenar algunos de los procesos fisiológicos relacionados con su maduración y/o senescencia (Knee et al., 1977; Abeles y Takeda, 1990). Aunque no se conoce con exactitud la función que las citoquinas o las giberelinas podrían desempeñar en el proceso de desarrollo y maduración del fruto, parece que podrían estar involucradas en la etapa de desarrollo del mismo (Lis et al., 1978). Además, se ha observado que el relación ABA/auxinas en el receptáculo es determinante y podría ser suficiente para iniciar el cambio de expresión génica necesario para que se produzca la transición de la etapa de desarrollo a la de maduración del fruto (Perkins-Veazie et al., 1995). Así, se ha propuesto que la disminución en la concentración de auxinas en el receptáculo del fruto podría ser el desencadenante de los cambios de expresión génica asociados a la etapa de maduración del fruto (Perkins-Veazie et al., 1995). Además, se ha propuesto que el programa transcripcional del proceso de maduración de la fresa podría ser inducido por el choque oxidativo generado, entre otras cosas, por el desarrollo y lignificación de los haces vasculares del fruto durante su crecimiento (Aharoni et al., 2002a). Por consiguiente, tanto la reducción de la concentración de auxinas como la producción de choque oxidativo son los mecanismos propuestos hasta ahora como responsables del desencadenamiento del proceso de maduración del fruto de fresa.Debido al gran interés que presenta el fruto de fresa recientemente se han estudiado mediante transgénesis diferentes genes relacionados con la producción y calidad de esta fruta. Así, para mejorar la tolerancia de la planta frente al estrés abiótico se han estudiado diferentes genes implicados en la resistencia al frío, al calor y al estrés oxidativo (NDong et al., 1997; Medina-Escobar et al., 1998; Llop-Tous et al., 2002; López et al., 2006). Por otra parte, para minimizar el efecto de diferentes agentes patógenos sobre este cultivo, también se ha procedido a la manipulación genética de la planta de fresa mediante transgénesis con el objetivo de reducir las pérdidas económicas de cada campaña. También se ha trabajado sobre la mejora de la floración y fructificación de la planta, mediante la regulación de las fitohormonas endógenas (Welander y Zhu, 2006), y en la mejora de las propiedades organolépticas del fruto mediante la alteración de la expresión de genes de pared, como expansinas, celulasas, PGs, PLs y PEs, involucrados directamente en el proceso del reblandecimiento del fruto (Mathews et al., 1995; Medina-Escobar et al., 1997; Woolley et al., 2001; Jimenez-Bermúdez et al., 2002; Benítez-Burraco et al., 2002; Spolaore et al., 2003; Salentijn et al., 2003; Palomer et al., 2006; Sesmero et al., 2007; Quesada et al., 2009), y de invertasas y alcohol acil transferasas relacionadas con el sabor y aroma del fruto respectivamente (Graham et al., 1997b; Aharoni et al., 2001; Gonzalez et al., 2009). Esto está permitiendo la obtención de frutos de fresa con mejores propiedades organolépticas y de mejor calidad.2. Contenido de la investigaciónDurante el desarrollo de esta tesis doctoral, se ha procedido al estudio de los cambios transcriptómicos que se producen en el receptáculo de fruto de fresa (Fragaria x ananassa cv Camarosa) durante su maduración empleando una plataforma de microarrays de oligos de fruto de fresa. Este análisis nos permitió seleccionar varios genes diana potencialmente implicados en el proceso de maduración del fruto y con gran importancia biotecnológica, ya que son determinantes de algunas de las propiedades organolépticas que influyen directamente en la calidad final del fruto de fresa. Uno de los genes seleccionados (FaAAT2) presentó homología de secuencia con genes de plantas superiores que codifican alcohol aciltransferasas (AATs), proteínas implicadas en la generación del aroma del fruto de fresa (Fellman et al., 2000). Estas enzimas participan en el último paso de la biosíntesis de ésteres volátiles, catalizando la esterificación de un resto acilo de acil-CoA con un alcohol (Aharoni et al., 2000; Olías et al., 2000; Fellman et al., 2000; Beekwilder et al., 2004). En este trabajo hemos determinado que existe una clara correlación entre el incremento de expresión del gen FaAAT2 y el aumento de la biosíntesis de ésteres volátiles a lo largo de la maduración de la fresa. Además, se ha comprobado que su expresión está regulada negativamente por las auxinas sintetizadas en los aquenios. Por otra parte, se analizó la actividad enzimática de la proteína recombinante FaAAT2 obtenida a partir del ADNc completo del gen FaAAT2 empleando una amplia variedad de acil-CoA y alcoholes. La enzima recombinante mostró actividad en presencia de alcoholes de cadena lineal y alcoholes aromáticos combinados con acetil CoA, aunque mostró preferencia por el cinnamil alcohol. El análisis de los posibles sustratos presentes en el fruto de fresa para esta enzima indicó que la proteína FaAAT2 mostró preferencia por alcoholes C6-C10, siendo más activa con hexanol seguida de octanol y heptanol. Por tanto, nuestros resultados sugieren que la proteína FaAAT2 puede producir ésteres como hexil acetato y octil acetato presentes en el fruto de fresa. Mediante el silenciamiento transitorio de la expresión del gen FaAAT2, se observó una reducción de la producción de volátiles en el fruto de fresa, lo que sugiere que la enzima FaAAT2 estaría implicada en la síntesis de compuestos volátiles y contribuiría de forma importante al aroma final del fruto de fresa.El segundo gen seleccionado para su estudio fue un factor de transcripción (FaMYB10) implicado en la regulación del metabolismo de los flavonoides/fenilpropanoides durante la maduración del fruto de fresa (Espley et al., 2007; Palapol et al., 2009; Niu et al., 2010; Lin-Wang et al., 2010; Petroni and Tonelli, 2011). La expresión de dicho gen resultó ser específica de receptáculo de fruto, inducible a lo largo de la maduración de éste y regulada por auxinas y ácido abscísico. Por otra parte, el análisis transcriptómico de frutos transgénicos con la expresión del gen FaMYB10 silenciada de forma transitoria indicó que muchos de los genes implicados en el metabolismo de flavonoides/fenilpropanoides [Early-regulated Biosynthesis Genes (EBGs): CHS, CHI, F3H, FLS; Late-regulated Biosynthesis Genes (LBGs): DFR , UFGT; y genes de la ruta general: PAL, C4H, 4CL] podrían estar regulados por este factor de transcripción. Hemos comprobado también que el gen FaMYB10 activa la expresión de los transportadores GST y MATE y parece regular muchos factores de transcripción implicados en la maduración de la fresa. Por tanto, nuestros resultados indican que el factor de transcripción FaMYB10 juega un papel importante en el proceso de maduración del fruto de fresa actuando como parte importante de la cascada de transducción de señales durante este proceso.3. Conclusión1- A partir de un microarray de oligos de fruto de fresa, se han seleccionado dos genes (FaAAT2 y FaMYB10) potencialmente implicados en el proceso de maduración del fruto.2- El gen FaAAT2 de fresa presenta homología significativa de secuencia con otros genes de plantas superiores implicados en la biogénesis del aroma del fruto.3.- La expresión del gen FaAAT2 aumenta significativamente en receptáculo de fruto de fresa durante su maduración y está negativamente regulada por auxinas. 4.- El gen FaAAT2 presenta su mayor actividad enzimática en presencia de alcoholes de cadena lineal y alcoholes aromáticos con acetil-CoA, siendo su sustrato favorito el cinnamil alcohol.5.- La proteína FaAAT2 tiene preferencia por los alcoholes C6-C10, siendo más activa con hexanol seguida de octanol y heptanol.6.- La producción de volátiles relacionados con el aroma del fruto de fresa maduro se redujo tras el silenciamiento transitorio de la expresión del gen FaAAT2 lo que indica una clara correlación entre la concentración de ésteres volátiles, el nivel de expresión de este gen y el aroma final del fruto de fresa.7.- El factor de transcripción FaMYB10 posee un papel importante en el control global del metabolismo de flavonoides/fenilpropanoides a lo largo del proceso de maduración del fruto de fresa.8.- La expresión del gen FaMYB10 se induce claramente durante el proceso de maduración del receptáculo de fruto de fresa, siendo apenas detectada en aquenios y en tejidos vegetativos. Además, dicha expresión se encuentra negativamente regulada por auxinas y es inducida por ácido abscísico. 9.- El silenciamiento transitorio de la expresión del gen FaMYB10 reduce los niveles de los genes que codifican a enzimas implicadas en la vía de flavonoides/fenilpropanoides. Por lo tanto, este TF regula los Early-regulated Biosynthesis Genes (EBGs), los Late-regulated Biosynthesis Genes (LBGs) y genes de la ruta general implicados en la producción de flavonoles y antocianinas en receptáculo de fruto maduro.10.- Los análisis transcriptómicos realizados en frutos transgénicos de fresa también mostraron que el gen FaMYB10 regula la expresión de otros genes aparentemente no implicados en el metabolismo de flavonoides/fenilpropanoide y de algunos TF implicados en el proceso de maduración de la fresa.4. BibliografíaAbeles F.B., Takeda F. (1990). Cellulase activity and ethylene in ripening strawberry and apple fruits. 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