INTRODUCCIÓN La apoptosis o muerte celular programada es un proceso fisiológico que implica a una serie de acontecimientos bioquímicos en cascada muy finamente regulados, de vital importancia en el desarrollo de los organismos multicelulares siendo esencial en algunos procesos fisiológicos y en donde las células activan su propia muerte (células suicidas). Es por tanto un importante programa de suicidio celular implicado en procesos tanto fisiológicos como patológicos. La apoptosis es un proceso fisiológico altamente regulado que está asociada con elevaciones en la [Ca2+]i y la producción de especies reactivas de oxígeno, lo que genera un colapso mitocondrial y liberación de factores mitocondriales propapoptóticos, que originan finalmente muerte celular. El factor de necrosis tumoral, TNF¿, una citoquina involucrada en inflamación sistémica, es un miembro de un grupo de citoquinas que estimulan la reacción de fase aguda. El papel primario del TNF está en la regulación de células inmunes. El TNF es capaz de inducir muerte celular apoptótica e inflamación e inhibir tumorigénesis y replicación viral. La desregulación de la producción de TNF se ha relacionado con una amplia variedad de enfermedades humanas, así como cáncer. Como todos los miembros que contienen dominios de muerte pertenecientes a la superfamilia de los receptores de TNF, TNF-R1 está involucrado en señalización de muerte. TRADD une FADD, el cual recluta a la cisteín-proteasa denominada caspasa-8. Una alta concentración de caspasa-8 induce su activación proteolítica seguida del corte y liberación de las caspasas efectoras, lo cual conduce a apoptosis celular. Este sería un ejemplo de los procesos apoptóticos que globalmente han sido denominados como vía extrínseca de la apoptosis. Por otro lado, la tecnología de los nanomateriales está evolucionando rápidamente y cada vez se encuentran más aplicaciones para este campo en crecimiento. En el caso concreto de la nanoceria, estudios de carácter físico-químicos han revelado que posee un gran potencial como antioxidante y aseguran que se trata de una sustancia inocua. Sin embargo, todavía se necesita una sólida cantidad de estudios biológicos que corroboren dicha presunción.Por todo esto, nuestro objetivo es profundizar en el esclarecimiento de los mecanismos intracelulares implicados en la apoptosis e inducida con el TNF, intentando analizar la participación de la mitocondria como orgánulo generador de agentes oxidantes. Así mismo trataremos de analizar la relación entre la señal de Ca2+ y los agentes oxidantes, y la posible participación de la producción endógena de EROs en la apoptosis inducida por TNF¿. Para ello, utilizaremos un tipo de células concreto, las células leucémicas promielocíticas humanas HL-60 diferenciadas a neutrófilos. Además, 5- comprobaremos el efecto de la nanoceria como agente antioxidante en la apoptosis producida por TNF¿ en la línea U937.DESARROLLO TEÓRICOUtilizamos como modelo las líneas celulares en cultivo HL-60, K562, U937. Realizamos determinaciones de la concentración de calcio intracelular, tanto en suspensiones celulares como en células aisladas. Por otro lado, medimos la actividad caspasa, así como el potencial de membrana mitocondrial y la generación de EROs intracelular. Además, evaluamos la actividad metabólica mediante el método de MTT y evaluamos la apoptosis mediante microscopía de fluorescencia y citometría.CONCLUSIONESAnalizando conjuntamente los resultados obtenidos en la realización de la presente Tesis Doctoral, podemos obtener las siguientes conclusiones:¿ Un agonista típico de los receptores de membrana en las células HL-60, como es el UTP, fue capaz de provocar liberación de Ca2+ desde los depósitos intracelulares. De una manera similar, el tratamiento con tapsigargina o con la especie reactiva de oxígeno H2O2 son capaces de inducir incrementos en la [Ca2+]c procedentes de los almacenes intracelulares.¿ La señal de Ca2+ inducida por UTP, tapsigargina y H2O2 fue capaz de producir despolarización mitocondrial y una estimulación tiempo dependiente de la actividad de la caspasa iniciadora -9 y de la ejecutora -3 en células HL-60. ¿ El TNF¿ fue capaz de producir apoptosis en las líneas celulares HL-60, K562 y U937, si bien en el caso de la última fue necesario el tratamiento con inhibidores de la síntesis proteica, como la cicloheximida (CHX) o la puromicina (PMC), a bajas concentraciones.¿ La señal apoptótica producida por el TNF¿ provocó un aumento de la generación de ROS intracelular, despolarización mitocondrial y aumento en la activación de la caspasa-9 en células HL-60, K562 y U937. De una manera similar, la preincubación con distintos antioxidantes disminuyeron la respuesta despolarizante mitocondrial así como la estimulación de la caspasa-9 inducida por TNF¿. ¿ El pretratamiento con nanoceria en células U937 no fue tóxico, y disminuyó la producción de ROS intracelular, la estimulación de las caspasas -3 y -9 y el porcentaje de células apoptóticas de una manera más potente que cualquiera de los antioxidantes clásicos, como el Trolox o la N-acetil cisteína (NAC).BIBLIOGRAFIA- Bejarano I, Lozano GM, Ortiz A, García JF, Paredes SD, Rodríguez AB, Pariente JA (2008) Caspase 3 activation in human spermatozoa in response to hydrogen peroxide and progesterone. Fertil Steril; 90: 1340-7.- Celardo I, De Nicola M, Mandoli C, Pedersen JZ, Traversa E, Ghibelli L (2011) Ce3+ Ions Determine Redox-Dependent Anti-apoptotic Effect of Cerium Oxide Nanoparticles. 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