La duplicación del genoma de una célula antes de su división es un proceso esencial en el ciclo celular. Escherichia coli posee un único cromosoma circular que es replicado de una forma precisa una vez por ciclo celular. El grupo de investigación donde se ha desarrollado esta Tesis Doctoral ha descrito y caracterizado en el cromosoma de E. coli la replicación inducida por estrés térmico, HIR (Heat Induced Replication), que escapa al control del ciclo celular (Botello, 1994; Botello y Jiménez-Sánchez, 1997; González-Soltero et al., 2006a; González-Soltero et al., 2006b; González-Soltero, 2007; González-Soltero et al., 2008; Guzmán et al., 1988; Jiménez-Sánchez et al., 1993). HIR inicia en oriC, requiere la proteína DnaA, no depende de la respuesta de choque térmico y, a diferencia de la replicación cíclica, no requiere la actividad de la RNA polimerasa ni la síntesis de proteínas de novo. En el replisoma de HIR intervienen tanto la DNA polimerasa III como la DNA polimerasa I. La necesidad de Pol I determina una diferencia fundamental con la composición del replisoma de la replicación cíclica y se ha observado que HIR es más lenta. HIR es estrictamente dependiente de la proteína de ensamblaje del primosoma PriA, utilizando la vía PriA-PriB, y la helicasa Rep. A diferencia de la replicación cíclica, HIR requiere la proteína RecA. Las funciones de RecA requeridas en la replicación termoinducida parecen estar relacionadas con la estabilización de las estructuras de los intermediarios de replicación, que serían más inestables que los de la replicación cíclica, y la recombinación homologa, pero no requiere su actividad proteasa, ni de reparación. También se detecta una dependencia parcial de la actividad helicasa de RecBCD. A pesar de requerir RecA y, parcialmente, RecBCD, HIR no puede ser considerada una replicación dependiente de recombinación (RDR) porque no se detectan roturas de DNA de cadena doble que pudieran generar un lazo-D como estructura de inicio para HIR.Una vez que HIR ha sido caracterizada y definida en E. coli, en este trabajo se amplía el estudio de HIR a otros replicones bacterianos. Se ha estudiado HIR en los genomas de especies bacterianas modelo alternativas a E. coli y en varios plásmidos de E. coli con diferente control de la replicación. El propósito global de este trabajo es el de conocer la generalidad del mecanismo de HIR en el mundo bacteriano y determinar los requerimientos, tanto fisiológicos como estructurales, de la replicación termoinducida en los diferentes replicones analizados. Otro aspecto de interés son los efectos de las replicaciones inducidas fuera del control cíclico sobre otros procesos y parámetros del ciclo celular, tanto en E. coli como en otras especies bacterianas.Se ha analizado la replicación en condiciones de estrés térmico en Salmonella tyhpimurium, que pertenece a la misma familia que E. coli e igualmente es una enterobacteria Gram negativa; en Bacillus subtilis, como organismo modelo de especies Gram positiva y cuyo hábitat natural es el medio ambiente; y en Vibrio cholerae, cuyo genoma está repartido en dos cromosomas a diferencia de la mayoría de las bacterias. El estudio de la replicación cromosómica se ha realizado analizando la síntesis de DNA in vivo por marcaje radiactivo, mediante citometría de flujo y por PCR cuantitativa (qPCR); adicionalmente se ha observado la distribución de nucleoides por microscopía de fluorescencia. Se ha determinado que los orígenes de replicación de todas las bacterias estudiadas, excepto oriCII de V. cholerae, inducen ciclos de replicación extras tras estrés térmico, aunque a diferentes niveles. Se sugiere una correlación entre la presencia de sitios SIDD, sitios de desestabilización del DNA inducida por estrés, en los orígenes de replicación y la inducción de HIR. En S. typhimurium, B. subtilis y V. cholerae, a diferencia de en E. coli, HIR depende parcialmente de la actividad de RecA. El aumento de temperatura a cultivos exponenciales llevó al aumento de la relación DNA/masa en E. coli, S. Typhimurium y V. cholerae, pero no en B. subtilis. En estas condiciones, en E. coli se detecta inicialmente la inducción de la replicación y a tiempos posteriores, de la división celular. Se ha determinado que la inducción HIR en E. coli ocurre de manera inmediata y transitoria tras el cambio de temperatura. Por tanto, la replicación inducida por estrés térmico no es exclusiva de E. coli y podemos considerar a HIR como un mecanismo de estrés generalizado en el mundo bacteriano.Para determinar si la replicación termoinducida es una respuesta específica de los cromosomas bacterianos o extensible a otros replicones, se ha estudiado si HIR tiene lugar en minicromosomas y plásmidos de E. coli. Los replicones analizados incluyen: minicromosomas con oriC y oriC sopABC; plásmidos con control de la replicación por iterones, con los orígenes de replicación de F, P1 ∆incA y pSC101; y plásmidos controlados por RNA antisentido, con los orígenes de R1, p15A y pBR322 (González-Soltero, 2007; Lobner-Olesen, 1999). Los minicromosomas y plásmidos analizados contienen el gen GFPmut2 clonado bajo el control del operón arabinosa. Se ha llevado a cabo la determinación del número de copias de plásmido o minicromosoma por cuantificación de la emisión de fluorescencia de GFPmut2, empleando espectrofluorimetría (pcn/masa), citometría de flujo (pcn/célula) y qPCR (pcn/volumen). A diferencia de los cromosomas bacterianos, los plásmidos estudiados no presentan HIR. El aumento de temperatura induce la replicación de minicromosomas y plásmidos como una adaptación a la nueva temperatura de crecimiento, que viene determinada por la velocidad de crecimiento. Se ha observado una correlación directa entre los parámetros pcn/masa y pcn/célula con la temperatura de crecimiento: a mayor temperatura, mayor número de copias. La presencia o ausencia de RecA afecta de manera diferente a la replicación de minicromosomas y plásmidos, dependiendo de las condiciones de crecimiento determinadas por la temperatura. La comparación de la cuantificación del número de copias de plásmido mediante espectrofluorimetría, citometría de flujo y qPCR, lleva a concluir que la espectrofluorimetría es el método más sencillo, rápido y preciso de los utilizados para la determinación de dosis génica en plásmidos con el gen GFPmut2.