TESIS
Reorganización Del Citoesqueleto Regulada Por Stim1 Y Orai1
2017-07-21
Programa De Doctorado En Biomarcadores De Salud Y Estados Patológicos Por La Universidad De Extremadura
Biologia Celular; Biologia Molecular; Bioquimica; Fisiologia Humana
DIRECTORES
Martin Romero, Francisco Javier (Director)
Pozo Guisado, Eulalia (Codirector)
TRIBUNAL
Da Silva Ferrada, Elisa Aida (Secretario)
Pérez Oliva, Ana Belén (Vocal)
Villalobos Jorge, Carlos (Presidente)
DESCRIPCIÓN
La migración es un proceso celular que requiere la reorganización del citoesqueleto cortical de actina en el frente de migración, siendo esencial la entrada de Ca2+ extracelular para esta reorganización. Sin embargo, la naturaleza molecular de los reguladores que participan en esta ruta de señalización permanece aún sin esclarecer. Por ello decidimos estudiar el papel de STIM1 y ORAI1 en la formación de las ondas o protrusiones de membrana plasmática, conocidas como ruffles, y la remodelación del citoesqueleto necesaria para la migración celular. Por otro lado nuestro grupo de investigación ha propuesto un modelo que relaciona la actividad de la quinasa ERK1/2 con la entrada de Ca2+ operada por depósitos (SOCE), así en este trabajo de Tesis Doctoral se ha estudiado la interdependencia de ERK1/2 y SOCE con objeto de determinar si existe alguna contribución real de SOCE sobre la actividad ERK1/2. Para ello se generó una línea celular deficiente en STIM1, y por tanto en SOCE, utilizando el sistema de edición genómica CRISPR/Cas9. La monitorización de los niveles de ERK1/2 en presencia o ausencia de Ca2+ en células PC3 STIM1-KO y wild-type nos permitió confirmar que la activación de la quinasa ERK1/2 en respuesta a EGF es independiente del influjo de Ca2+ extracelular y dependiente de la actividad de la quinasa Src.Con relación al estudio de la regulación del citoesqueleto mediada por SOCE, nuestros resultados muestran que el pool de STIM1 fosforilado se concentra en el frente de células en migración, y también que ORAI1 co-localiza con cortactina (CTTN), un regulador del citoesqueleto en regiones de ruffling de membrana. Mediante la utilización del sistema de edición genómica CRISPR/Cas9 en células U2OS se generaron las líneas celulares STIM1-KO y ORAI1-KO. En ambas líneas se observó una notable reducción de SOCE, efecto que pudo revertirse con la sobre-expresión ectópica de STIM1-mCherry o ORAI1-mCherry, respectivamente. Además, en estas líneas KO se midió la dinámica de los ruffles de membrana mediante la monitorización de la intensidad de fluorescencia de GFP-CTTN en dichas áreas de la célula. Como resultado observamos que estas líneas presentan un menor número de ruffles de membrana y una dinámica del citoesqueleto débil y más lenta con respecto a las células U2OS wild-type. Todo ello permite concluir que STIM1 y ORAI1 son los principales mediadores del influjo de Ca2+ extracelular que permite el ruffling de membrana necesario para la migración celular. Además, nuestros datos revelaron que tanto ORAI1 endógeno como ORAI1-GFP co-precipitan con CTTN, y que esta interacción es dinámica y sensible al estado de llenado de depósitos intracelulares.En resumen, nuestros resultados apoyan un mecanismo de regulación de la migración celular basada en la localización polarizada de STIM1 y ORAI1, de modo que ambas proteínas permiten el influjo de Ca2+ extracelular localizado en el frente de migración. En situación de reposo STIM1 permanece unido a EB1, mientras que ORAI1 permanece unido a CTTN. Bajo un estímulo que permita una depleción parcial de depósitos intracelulares de Ca2+, STIM1 se disocia de EB1 (mediante la fosforilación de STIM1 en sitios diana de ERK1/2), y ORAI1 se disocia de CTTN, por un mecanismo que aún desconocemos, para permitir la unión STIM1-ORAI1 y la activación de SOCE que regula la formación de filopodios y lamelipodios.