MOTIVACIÓN DE LA TESIS DOCTORALLa crisis que vienen atravesando las dehesas, como consecuencia de su baja rentabilidad económica y la degradación ambiental, ha generado una creciente preocupación entre propietarios y otros agentes sociales que demanda una respuesta urgente desde la administración pública y el sector de la investigación aplicada. La presente propuesta trata de dar respuesta a esta problemática, proporcionando un valor añadido a las producciones de la dehesa (en este caso a las producciones agrícolas), de tal forma que el propietario pueda complementar sus rentas, y hacer al sistema más sostenible y que ayude a su perpetuación. En este marco, se propone la obtención de productos agrícolas ricos en selenio (Se) y zinc (Zn) de tres cultivos básicos en la alimentación humana y animal, como son el trigo harinero, trigo semolero y guisante, y proporcionar dichos alimentos como “alimentos funcionales”. El Se y el Zn son micronutrientes esenciales para el hombre y para los animales en los que, su deficiencia acarrea múltiples problemas de salud. A pesar de ello, se ha estimado que un 15% de la población mundial tiene deficiencia en Se y un 30% en Zn. Para paliar estas deficiencias, la biofortificación agronómica, que consiste en la adición de fertilizantes para incrementar la concentración de minerales en la planta, se ha mostrado como una técnica muy eficaz.Por tanto, viendo la importancia de aumentar la ingesta de Se y Zn en la población extremeña y por ende, mejora su salud, y para intentar mejorar la rentabilidad de la dehesa, los objetivos de esta Tesis se pueden concretar en: (i) evaluar la influencia de la aplicación de Se y Zn, tanto por separado como en combinación, sobre la acumulación y biodisponibilidad de estos minerales en las partes comestibles (forraje y grano) de los tres cultivos indicados; (ii) evaluar las pérdidas de Se y Zn en los procesos de transformación de la materia prima al producto final (pan y pasta); (iii) evaluar la influencia de la aplicación de Se y Zn, tanto por separado como en combinación, sobre el rendimiento, componentes del rendimiento y parámetros de calidad de los diferentes cultivos; y (iv) evaluar la evolución del contenido de Zn en el suelo tanto para controlar posibles contaminaciones, como para realizar un manejo más racional de este elemento. DESARROLLO TEÓRICOCon el propósito de aumentar la rentabilidad de las dehesas y producir “alimentos funcionales” se ha planteado esta Tesis Doctoral. En ella se contempla la implementación, en tres cultivos básicos de la alimentación humana y animal como son el trigo harinero (Triticum aestivum L.), trigo semolero (T. durum L.) y guisante forrajero (Pisum sativum L.), de un programa de biofortificación con selenio (Se) y zinc (Zn), micronutrientes que aún siendo esenciales en animales y humanos, entre un 15% de la población mundial en el caso del Se y un 30% en el del Zn presenta una ingesta deficiente. Para ello se llevó a cabo un ensayo de campo en parcelas subdivididas durante los años agrícolas 2017/2018 y 2018/2019 en el que se estudió como tratamiento principal la aplicación de Zn en el suelo siendo NoS, la no aplicación de Zn y ZnS la aplicación al suelo de 50 kg de ZnSO4-7H2O ha-1 previo a la siembra y únicamente el primer año de cultivo; y como subparcela se estudió la aplicación foliar de cuatro tratamientos: NoF, ninguna aplicación foliar; ZnF, aplicación foliar de 4 kg ZnSO4-7H2O ha-1 al inicio de la floración y dos semanas después; SeF, aplicación foliar de 10 g Se ha-1 aplicada como Na2SeO4 dos semanas después del inicio de la floración; ZnF+SeF, aplicación foliar conjunta de ZnF y SeF. Los objetivos específicos se pueden resumir en cuatro: i) estudiar la evolución del contenido de Zn en el suelo en los tratamientos que incluyan la aplicación inicial de Zn; ii) valorar la influencia de la aplicación individual y combinada de Se y Zn sobre el rendimiento y los principales parámetros de calidad de cada cultivo; iii) y sobre la absorción, acumulación y biodisponibilidad en las partes comestibles de cada cultivo y; iv) evaluar las pérdidas en los procesos de transformación, mediante el análisis de la concentración de Se y Zn en la harina y en el pan, en el caso del trigo harinero, y de la pasta en el caso del trigo semolero. CONCLUSIONESEl presente estudio muestra que las acusadas diferencias climáticas acontecidas entre los dos años de cultivo, influyeron significativamente sobre el rendimiento, los parámetros de calidad, la absorción de nutrientes y la biodisponibilidad de los mismos en los diferentes cultivos estudiados. En todos los casos, fue el año agrícola 2017/2018 el que obtuvo unos mayores rendimientos siendo en torno al doble en grano y paja tanto del trigo harinero como semolero, y un 25% superior en el forraje de guisante, con mayores peso de los 1000 granos, peso hectólitro y rendimiento en harina, mientras que en el año 2018/2019, los trigos tuvieron mayor calidad en referencia al contenido proteico, contenido en gluten y vitrosidad. Sin embargo, el forraje de guisante fue más rico en contenido proteico y fibra en el año agrícola 2017/2018.Las conclusiones obtenidas de cada uno de los objetivos perseguidos son las siguientes:OBJETIVO I EVOLUCIÓN DEL CONTENIDO DE LA APLICACIÓN DE ZN AL SUELO. La aplicación de Zn al suelo triplicó la concentración de Zn biodisponible en el suelo, situándose por encima del límite crítico para el correcto desarrollo de los cultivos y manteniéndose durante al menos las dos campañas estudiadas. No obstante, hay que continuar analizando estos suelos para determinar cuál es la persistencia real de esta aplicación inicial.OBJETIVO II INFLUENCIA DE LA APLICACIÓN INDIVIDUAL Y COMBINADA DE SE Y ZN SOBRE EL RENDIMIENTO Y CALIDAD DE CADA CULTIVO. La aplicación de Zn al suelo aumentó el rendimiento de media un 13% en la biomasa de guisante y en la paja y grano de ambos trigos, aumentando un 7% el peso de los 1000 granos y un 2% del peso hectólitro mejorando la aptitud para el procesado del trigo harinero. Entre los tratamientos foliares aplicados, tanto la aplicación individual de Zn como la combinada con Se, fueron los que más favorecieron la calidad del forraje de guisante provocando un aumento del 8% en el contenido de proteína, aumentando un 10%, en su formulación conjunta, el rendimiento en grano de los trigos. Por contra, los tratamientos que incluyeron Se (SeF y ZnF+SeF) provocaron un descenso del 8% del gluten seco. OBJETIVO III INFLUENCIA DE LA APLICACIÓN INDIVIDUAL Y COMBINADA DE SE Y ZN SOBRE LA ABSORCIÓN, ACUMULACIÓN Y BIODISPONIBILIDAD MINERAL (CA, FE, MG, ADEMÁS DE SE Y ZN). La aplicación de Zn al suelo no produjo ningún efecto sobre los nutrientes y su biodisponibilidad en el forraje de guisante. En el grano de trigo harinero provocó significativas reducciones del Ca (6%), Fe (7%) y del ratio molar fitato:Zn (7%) con un aumento del ácido fítico (3%), mientras que en la paja se redujo de forma significativa la concentración de Mg un 14% aunque aumentó la biodisponibilidad del Ca y Fe, por la reducción de sus ratios un 11% y un 8%, respectivamente. En la paja del trigo semolero aumentó un 18% la concentración de Zn mejorando en un 33% su ratio molar. Los tratamientos foliares de Se y Zn aplicados individualmente supusieron multiplicar por 3 y 4,5 veces la concentración media de estos nutrientes, respectivamente, en todos los productos estudiados. No obstante, fue la aplicación combinada la que presentó un aumento mayor, de media 3,3 y 4,7 veces las concentraciones de Se y Zn, mostrando un efecto sinérgico sobre el Se en todos los cultivos estudiados. En el resto de nutrientes analizados, la aplicación Se produjo un aumento significativo de Ca y Mg, así como de la biodisponibilidad del Ca, Fe y Mg en el forraje de guisante, no mostrando efectos en los trigos. Los tratamientos foliares que incluyeron Zn tampoco influyeron sobre la concentración de estos minerales en los trigos, sólo una reducción del 30% en la concentración de Fe en el forraje de guisante, aunque sí sobre la biodisponibilidad de Fe y Mg, que sufrieron un descenso, en torno al 19% y del 13%, en el forraje de guisante, y de un 12% en el trigo semolero, aunque en todos los casos presentando buena disponibilidad, y sobre todo en la del Zn, en la que el tratamiento combinado provocó una disminución de 3,4 veces el ratio presentado por el forraje no biofortificado. En el trigo harinero, la reducción del ratio molar fitato:Zn tanto en el grano como en la paja fue de media un 24% y un 91% inferior, respectivamente, siendo de un 33% y un 87% en el trigo semolero. OBJETIVO IV EFECTO DEL PROCESADO DE LOS TRIGOS SOBRE EL CONTENIDO MINERAL EN LOS DISTINTOS TRATAMIENTOS ESTUDIADOS. Tanto la molienda como el procesado de los trigos para obtener pasta o pan redujeron notablemente la concentración de los nutrientes. En el trigo harinero, el Se fue el menos perjudicado, con un descenso del 11%, 21% y 29% en harina refinada, pan blanco e integral, mientras que las pérdidas de Zn fueron del 37%, 66% y 19%, respectivamente. En el trigo semolero, la molienda y el cocinado de los espaguetis redujo los niveles de Se y Zn en la sémola y en la pasta un 11% y un 43%, en la sémola aumentó la concentración de Se un 28% y se redujo en un 47% la de Zn. Con respecto al Ca, Fe y Mg tanto la obtención de la harina refinada como de la sémola y la pasta cocinada sufrieron unas reducciones en torno al 40% - 50%, mientras que la fermentación y cocción de los panes provocó unas menores pérdidas en el pan blanco siendo del 40% en el Ca y Fe y del 19% en el Mg, provocando una biodisponibilidad un 40 - 50% inferior. En el pan integral, por el contrario, no se observaron disminuciones en los mismos, lo que provocó menores caídas en la biodisponibilidad debido al procesado, con una disminución de un 27% en el Ca, Fe y Mg y de un 9% en el Zn.Por todo lo expuesto, se concluye que la mejor opción para conseguir un significativo aumento de Se y Zn y así conseguir alimentos enriquecidos para suplir las deficiencias de ambos nutrientes en animales y humanos es la aplicación del tratamiento foliar ZnF+SeF, que es la que alcanzó mayores concentraciones de ambos nutrientes en todos los cultivos estudiados y mejoró significativamente la biodisponibilidad del Zn facilitando su absorción por el organismo. Así mismo, empleando estos tratamientos junto con la fertilización en el suelo, se conseguirá aumentar de forma significativa el rendimiento y, en general, los parámetros de calidad de todos los cultivos estudiados, permitiendo cubrir los costes de las aplicaciones tanto por el incremento de la producción además del posible valor añadido que supone la obtención de estos alimentos funcionales por su mayor riqueza en Se y Zn.BIBLIOGRAFÍAAACC International (2000). Approved Methods of the American Association of Cereal Chemists (10th ed.). The Association, St. Paul, MN, USA.AACC International 10-09.01 (2012). Basic Straight-Dough Bread-Baking Method – Long Fermentation. Approved Methods of the American Association of Cereal Chemists (11th ed.). The Association, St. Paul, MN, USA.Abid M, Ahmend N, Qayyum MF, Shaaban M, Rashid A (2013). Residual and cumulative effect of fertilizer zinc applied in wheat-cotton production system in an irrigated aridisol. Plant Soil Environ. 11: 505-510.Alloway BJ (2009). Soil factors associated with zinc deficiency in crops and humans. Environ. Geochem. Health 31: 537-548.AOAC (2009). Crude Fiber Analysis in Feeds by Filter Bag Technique Ba 6a-05. Arlington, USA.Arthur JR (2003). Selenium supplementation: does soil supplement help and why? Proc. Nutr. Soc. 62: 393- 397.Bouis, H.E., Hotz, C., McClafferty, B., Meenakshi, J.V., Pfeiffer, W.H. (2011). Biofortification: a new tool to reduce micronutrient malnutrition. Food Nutr. Bull. 32: S31-S40.Broadley MR, White PJ, Bryson RJ, Meacham MC, Bowen HC, Johnson SE, et al. (2006). Biofortification of UK food crops with selenium. Proc. Nutr. Soc. 65: 169-181.Broadley MR, White PJ, Hammond JP, Zelko I, Lux A (2007). Zinc in plants. New Phytol. 173: 677–702.Cakmak I (2008). Enrichment of cereal grains with zinc: Agronomic or genetic biofortification? Plant Soil 302: 1–17.Cakmak I, Kalayci M, Kaya Y, Torun AA, Aydin N, Wang Y, et al. (2010). Biofortification and Localization of Zinc in Wheat Grain. J. Agric. Food Chem. 58: 9092–9102.Chu J, Yao X, Yue Z, Li J, Zhao FJ (2013). The effects of selenium on physiological traits, grain selenium content and yield of winter wheat at different development stages. Biol. Trace Elem. Res. 151: 434-440.Combs GF (2001). Selenium in global food systems. Brit. J. Nutr. 85: 517-547. Curtin D, Hanson R, van der Weerden TJ (2008). Effect of selenium fertilizer formulation and rate of application on selenium concentrations in irrigated and dryland wheat (Triticum aestivum). N. Z. J. Crop Hortic. Sci. 36: 1-7.Díaz-Alarcón JP, Navarro-Alarcón M, de la Serrana HL, López-Martínez MC (1996). Determination of selenium in cereals, legumes and dry fruits from south-eastern Spain for calculation of daily dietary intake. Sci. Total Environ. 184: 183-189.Eich-Greatorex S, Sogn TA, Øgaard AF, Aasen I (2007). Plant availability of inorganic and organic selenium fertilizer as influenced by soil inorganic matter content and pH. Nutr. Cycl. Agroecosyst. 79: 221-231.Elmadfa I (2009). The European Nutrition and Health Report. Forum of Nutrition, Vienna, 62: 412 pp. Eurola MH, Ekholm PI, Ylinen ME, Koivistoinen PE, Varo PT (1991). Selenium in Finnish foods after beginning the use of selenate supplemented fertilizers. J. Sci. Food Agric. 56: 57–70.Fairweather-Tait SJ, Bao Y, Broadley MR, Collings R, Ford D, Hesketh JE, Hurst R (2011). Selenium in human health and disease. Antioxid. Redox Sig. 14: 1337-1383.Fordyce F (2005). Selenium deficiency and toxicity in the environment. In Essentials of Medical Geology, 373-415.Gargari BP, Mahboob S, Razavieh SV (2007). Content of phytic acid and its mole ratio to zinc in flour and breads consumed in Tabriz, Iran. Food Chem. 100: 1115-1119.Germ M, Pongrac P, Regvar M, Vogel-Mikuš K, Stibilj V, Jaćimović R, Kreft I (2013). Impact of double Zn and Se biofortification of wheat plants on the element concentrations in the grain. Plant Soil Environ. 59(7): 316–321. Gibson RS, Hess SY, Hotz C, Brown KH (2008). Indicators of zinc status at the population level: a review of the evidence. Br. J. Nutr. 99: 14–23.Gomez-Coronado F (2015). Tesis doctoral. Biofortificación agronómica y genética con Zinc de genotipos de trigo harinero (Triticum aestivum L.) en clima mediterráneo. Directores: Poblaciones MJ; Almeida AS.Gomez-Coronado F, Poblaciones MJ, Almeida A, Cakmak I (2016). Zinc (Zn) concentration of bread wheat grown under Mediterranean conditions as affected by genotype and soil/foliar Zn application. Plant Soil 401: 331-346.Graham RD, Welch RM, Saunders, DA, Ortiz-Monasterio I, Bouis HE, Bonierbale M, et al. (2007). Nutritious subsistence food systems. Adv. Agron. 92: 1-74.Hart DJ, Fairweather-Tait SJ, Broadley MR, Dickinson SJ, Foot I, Knott P, McGrath SP, et al. (2011). Selenium concentration and speciation in biofortified flour and bread: Retention of selenium during grain biofortification, processing and production of Seenriched food. Food Chem. 126: 1771-1778.Hawkesford MJ, Zhao FJ (2007). Strategies for increasing the selenium content of wheat. J. Cereal Sci. 46: 282–292.Hotz C, Brown KH (2004). Assessment of the risk of zinc deficiency in populations and options for its control. Food Nutr. Bull. 25: 91-204.Huerta VD, Reyes LH, Marchante-Gayon JM, Sanchez MLF, Sanz-Medel A (2003). Total determination and quantitative speciation analysis of selenium in yeast and wheat flour by isotope dilution analysis ICP-MS. J. Anal. At. Spectrom, 18: 1243-1247.Levenson CW, Morris D (2011). Zinc and neurogenesis: making new neurons from development to adulthood. Adv Nutr 2: 96–100.Li HF, McGrath SP, Zhao FJ (2010). Selenium uptake, translocation and speciation in wheat supplied with selenate or selenite. New Phytologist, 178, 92-102.Lindsay WL, Norvell WA (1978). Development of a DTPA soil test for zinc, iron, manganese and copper. Soil Sci. Soc. Am. J. 42: 421-428.McGrath SP, Poblaciones MJ, Rodrigo S (2013). Biofortification of field crops with selenium in Mediterranean conditions. En: Selenium and Environment and Human Health. pp. 115- 116. MAGRAMA (2018). http://www.magrama.gob.es/es/estadistica. Último acceso 4 de julio 2020.Mao H, Wang J, Wang Z, Zang Y, Lyons G, Zou C (2014). Using agronomic biofortification to boost zinc, selenium, and iodine concentrations of food crops grown on the loess plateau in China. J. Soil Sci. Plant Nutr. 14 (2): 459-470.Mensink GB, Fletcher R, Gurinovic M, Serra-Majem L, Szponar L, Tetens I, et al. (2013). Mapping low intake of micronutrients across Europe. The British Journal of Nutrition 110: 755–773.Morris ER, Ellis R (1989). Usefulness of the dietary phytic acid/zinc molar ratio as an index of zinc bioavailability to rats and humans. Biol. Trace Elem. Res. 19: 107-117.Naciones Unidas (2010). Millennium development goals report 2010. UN Web service Section. http://www.un.org/milleniumgoals/.National Research Council Dietary (NRCD) (2001). Reference intakes for vitamin A, vitamin K, arsenic, boron, chromium, copper, iodine, iron, manganese, molybdenum, nickel, silicon, vanadium, and zinc . Institute of Medicine/Food and Nutrition Board. National Academy Press. Washington DC. New York, 37-46.Olea L, Paredes J (1997). Influencia de la superficie disponible y del tamaño del rebaño en los pastos mejorados y en la producción de la dehesa en el S.O. de España Pastos 27: 219- 247.Olea L, San Miguel A (2006). The Spanish dehesa. A Mediterranean silvopastoral system linking production and nature conservation. Grassland Science in Europe, 11: 3-13.Poblaciones MJ, Rodrigo S, Santamaria O (2013). Evaluation of the potential of peas (Pisum sativum L.) to be used in selenium biofortification programs under Mediterranean conditions. Biological Trace Element Res. 151: 132-137.Poblaciones MJ, Rodrigo S, Santamaría O, Chen Y, McGrath SP (2014a). Selenium accumulation and speciation in biofortified chickpea (Cicer arietinum L.) under Mediterranean conditions. J. Sci. Food Agric. 94: 1101-1106.Poblaciones MJ, Rodrigo S, Santamaria O, Chen Y, McGrath SP (2014b). Agronomic selenium biofortification in Triticum durum under Mediterranean conditions: from grain to cooked pasta. Food Chem. 146: 378-384.Poblaciones MJ, Santamaria O, Garcia-White T, Rodrigo S (2014c). Selenium biofortification in bread-making wheat under Mediterranean conditions: influence on grain yield and quality parameters. Crops Pasture Sci. 65(4): 362-369.Poblaciones MJ, Rodrigo S, Santamaria O (2015a). Biofortification of legumes with Selenium in Semiarid Conditions. Selenium: Chemistry, Analysis, Functions and Effects, 1, pp 324-340. Ed: Royal Society of Chemistry (Reino Unido).Poblaciones MJ, Rodrigo S, Santamaria O (2015b). Biofortification of legumes with selenium in semiarid conditions. En; Selenium: chemistry, analysis, functions and effects. Ed. Royal Society of Chemistry, pp. 1-33.Poblaciones MJ, Rengel Z (2016). Soil and foliar zinc biofortification in field pea (Pisum sativum L.): grain accumulation and bioavailability in raw and cooked grains. Food Chem. 212: 427 - 433. Pulido F, Picardo A (2010). Libro Verde de la Dehesa. Consejería de Medio Ambiente (Junta de Castilla y León), Sociedad Española de Ciencias Forestales (SECF), Sociedad Española para el Estudio de los Pastos (SEEP), Asociación Española de Ecología Terrestre (AEET) y Sociedad Española de Ornitología (SEO).Quintas A, Pereira MS, Carmona PJ, Ramirez-Cruzado D, Belo CC (2004). The influence of climate and soil type on the “monatdo“ production system. Silvopastoralism and Sustainable Land Management. Ed. CABI Publishing, pp: 46-49.Rayman MP (2012). Selenium and human health. The Lancet, 379: 1256-1268. Reid ME, Duffield-Lillico A, Slate E, Natarajan N Turnbull B, Jacobs E, et al. (2008). The nutritional prevention of cancer: 400 Mcg per day selenium treatment. Nutr. Cancer 60(2): 155-163.Rengel Z, Graham RD (1995). Importance of seed zinc content for wheat growth on Zndeficient soil. I. Vegetative growth. Plant Soil 173: 259-266.Riveros E, Argamentería A (1987). Métodos enzimáticos de predicción de la digestibilidad in vivo de la materia orgánica de forrajes. 1. Forrajes verdes. 2. Ensilados y pajas. Avances en Producción Animal 12-49.Rodrigo S, Santamaria O, Lopez-Bellido FJ, Poblaciones MJ (2013). Agronomic selenium biofortification of two-rowed barley under Mediterranean conditions. Plant, Soil Environ. 59: 115-120.Rodrigo S, Santamaria O, Poblaciones MJ (2014a). Selenium Application Timing: Influence in Wheat Grain and Flour Selenium Accumulation under Mediterranean Conditions. J. Agric. Sci. Vol. 6(3): 23-30.Rodrigo S, Santamaria O, Chen Y, McGrath SP, Poblaciones MJ (2014b). Selenium speciation in malt, wort and beer made from selenium biofortified two rowed barley grain. J. Agric. Food Chem. 62: 5948-5953.Rosa DE, Fazzio LE, Picco SJ, Furnus CC, Mattioli GA (2008). Metabolismo y deficiencia de zinc en bovinos. Laboratorio de nutrición mineral y fisiología reproductiva. Comisión Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas.Sanchez C, Lopez-Jurado M, Planells E, Llopis J, Aranda P (2009). Assessments of iron and zinc intake and related biochemical parameters in an adult Mediterranean population from southern Spain: influence of lifestyle factors. J. Nutr. Biochem. 20: 125-131.Stroud JL, Li H F, Lopez-Bellido FJ, Broadley MR, Foot I, Fairweather-Tait SJ, et al. (2010). Impact of sulphur fertilisation on crop response to selenium fertilisation. Plant Soil 332: 31-40.Thavarajah D, Thavarajah P, Sarker A, Vandernberg A (2009). Lentils (Lens culinaris Medikus subsp. culinaris): a whole food for increased iron and zinc intake. J. Agric. Food Chem. 57: 5413-5419.Terrés C, Navarro M, Martín-Lagos F, Giménez R, López H, López MC (2001). Zinc levels in foods from southeastern Spain: relationship to daily dietary intake. Food Addit. Contam. 8: 687-695.Weber E, Bleiholder H (1990). Erläuterungen zu den BBCH-Dezimal-Codes für die Entwicklungsstadien von Mais, Raps, Faba-Bohne, Sonnenblume und Erbse – mit Abbildungen. Gesunde Pflanzen 42: 308-321. White PJ, Broadley MR (2005). Biofortifying crops with essential mineral elements. Trends Plants Sci. 10: 586-593.WHO/FAO, World Health Organization and Food and Agriculture Organization of the United Nations. (2009). Global Health Risks, Mortality and burden of disease attributable to selected major risks, World Health Organization pp 1-70.Zadoks JC, Chang TT, Konzak CF (1974). A decimal code for the growth stages of cereals. Weed Res. 14: 415-421.Zhao FJ, McGrath SP (1994). Extractable sulphate and organic sulphur in soils and their availability to plants. Plant Soil 164: 243-250.Zhao FJ, McGrath SP (2009). Biofortification and phytoremediation. Current Op. Plant Biol. 12: 373-380.