Las condiciones ambientales relacionadas con el proceso de elaboración, almacenamiento y las características intrínsecas de los derivados cárnicos curado-madurados y cereales/frutos secos favorecen el crecimiento de mohos en la superficie de los mismos. En los derivados cárnicos curado-madurados, P. nordicum y P. verrucosum contaminan de forma habitual estos productos y sus derivados con ocratoxina A (OTA); mientras que en el caso de los cereales y frutos secos, es frecuente encontrar cepas de las especies A. flavus y A. parasiticus que pueden producir aflatoxinas. Tanto OTA como aflatoxinas son metabolitos fúngicos extremadamente tóxicos con diferentes efectos teratogénicos, neurológicos y carcinogénicos que pueden tener efectos perjudiciales en la salud de los consumidores. Debido a la toxicidad y alta incidencia de estas micotoxinas en estos alimentos, la Unión Europea y algunos países productores han establecido estrictos límites para estas micotoxinas en distintos productos alimenticios entre los que se encuentran los cereales y los derivados cárnicos curado-madurados. La acumulación de micotoxinas por encima de los límites supone un importante riesgo en la salud de los consumidores al ser estos productos y sus derivados alimentos con un elevado consumo. Además representa un serio problema para la exportación de estos productos a otros países. Todo ello conlleva grandes pérdidas económicas a agricultores y productores. Por lo que el diseño de estrategias eficientes que permitan minimizar la acumulación de estos compuestos tóxicos en los alimentos, evitando así el correspondiente riesgo sanitario, dado que la comercialización de alimentos libres de micotoxinas es un objetivo primordial tanto para la industria como para la sociedad. Entre estas estrategias aquellas que faciliten la detección y cuantificación temprana de mohos viables productores de OTA y aflatoxinas antes de la producción de dichas micotoxinas permitirían la adopción inmediata de medidas preventivas eliminando materias primas contaminadas y evitando de esta forma que los productos elaborados tengan micotoxinas. En este sentido, sería necesario disponer de métodos rápidos y eficaces que permitan estudiar los cambios en la expresión de genes implicados en la biosíntesis de OTA y aflatoxinas que puedan ser incorporados a los programas de monitorización y verificación de sistemas de análisis de peligros y puntos de control crítico (APPCC). Dentro de estos métodos, aquellos basados en la PCR en tiempo real de transcripción inversa (RT-qPCR) son capaces de detectar y cuantificar el ARNm transcrito de los genes implicados en las rutas biosintéticas de las micotoxinas. Esta técnica es muy sensible y permite la cuantificación de pequeños cambios en la expresión génica, por lo que podría utilizarse como un buen indicador para determinar el riesgo de producción de micotoxinas por determinadas especies de mohos toxigénicas.En la actualidad, se han llevado a cabo algunos estudios en los que relacionan el crecimiento de una especie de moho toxigénica, con la expresión genes implicados en la biosíntesis de las micotoxinas mediante RT-qPCR y con su producción de las mismas en diferentes medios de cultivos elaborados a base de distintas matrices alimentarias. Sin embargo desde el punto de vista de la Seguridad Alimentaria sería necesario disponer de métodos de RT-qPCR que permitan detectar y cuantificar la expresión de dichos genes antes que se produzca la micotoxina en el alimento. Los objetivos de este trabajo son los de desarrollar técnicas de RT-qPCR que permitan analizar cambios temporales de la expresión de genes implicados en la biosíntesis de OTA y aflatoxinas en derivados cárnicos curado-madurados y cereales/frutos secos, respectivamente. Se pretende además evaluar la aplicabilidad de estos métodos relacionando los cambios en la expresión génica con la producción de las micotoxinas en distintas matrices alimentarias.Previamente al desarrollo de los métodos de RT-qPCR se optimizó un protocolo de extracción de ARN de mohos a partir de alimentos con una adecuada calidad y cantidad para ser utilizado en estudios de expresión génica mediante RT-qPCR. Para ello, se evaluaron 6 protocolos de extracción de ARN de mohos a partir de alimentos, que combinaron distintos métodos de ruptura de esporas, tampones y kits de extracción comerciales y disolventes de extracción de ARN. Se seleccionó el método “Mortero-RNeasy” que combina la ruptura de la pared celular del moho en un mortero con la ayuda de nitrógeno líquido y el kit RNeasy por obtenerse con él cantidades adecuadas de ARN de alta calidad y no contaminadas con ADN genómico. Los cebadores de los métodos de RT-qPCR desarrollados para analizar la expresión de genes implicados en la biosíntesis de OTA se diseñaron a partir de los genes otapks y otanps. Además, se desarrollaron también cebadores a partir de los genes estructurales β-tubulina, COI e ITS utilizándose como controles endógenos. Estos métodos fueron adecuadamente validados para ser utilizados en el análisis de la expresión génica relativa siguiendo los dos requisitos establecidos por el método 2-ΔΔCt. Entre los tres controles endógenos optimizados, el gen β-tubulina fue seleccionado para cuantificar cambios en la expresión de los genes clave en relación con la síntesis de OTA por P. nordicum y P. verrucosum en condiciones relacionadas con la maduración del jamón curado y embutidos curado-madurados. Los métodos de RT-qPCR desarrollados fueron utilizados para evaluar la expresión en las propias matrices cárnicas. En el caso de los métodos diseñados para detectar mohos productores de OTA se comprobó que sólo aquel método que permitía el estudio de los cambios del gen otapks por P. nordicum y P. verrucosum fue adecuado y sensible para el estudio de la expresión temprana de este gen. Este método puede ser de gran utilidad para predecir la acumulación de OTA en embutidos curado-madurados. Para el estudio de los cambios en la expresión de genes relacionados con la síntesis de aflatoxinas, se emplearon métodos de RT-qPCR basados en los genes aflP, aflR y aflS pertenecientes al grupo de genes que codifican la producción de aflatoxinas. En el caso de los genes aflP y aflR se utilizaron cebadores previamente publicados, mientras que se diseñaron nuevos cebadores para amplificar el gen aflS. Todos los métodos de RT-qPCR para la detección de mohos viables productores de aflatoxinas utilizaron el gen β-tubulina como control endógeno siendo adecuados y sensibles para el estudio de la expresión temprana de los genes aflP, aflR y aflS en A. flavus y A. parasiticus en cereales y frutos secos. Aunque se observó que el gen aflR no estaba relacionado con la producción de aflatoxinas por A. flavus en un medio elaborado con maíz; sí se comprobó posteriormente que dicha expresión junto con aquella obtenida en los genes aflP and aflS se correlacionaban con la síntesis de las mismas por A. flavus y A. parasiticus en la propia matriz, así como en cacahuete y trigo. En el caso del cacahuete, sería necesario la realización de más estudios debido a que aunque hubo buena relación entre la expresión génica y la producción de aflatoxinas, tanto A. flavus como A. parasiticus produjeron aflatoxinas a los 4 días de incubación.Si bien sería conveniente realizar más ensayos en otras matrices alimentarias y con más cepas de mohos, los resultados de aplicación en las muestras alimentarias obtenidos, parecen indicar que los protocolos de RT-qPCR diseñados son de gran utilidad para la monitorización y vigilancia de mohos viables productores de OTA y aflatoxinas en los sistemas APPCC de la industria alimentaria. Por todo ello se proponen estos protocolos para la cuantificación de cambios temporales en la expresión génica de mohos toxigénicos en alimentos, especialmente en las primeras etapas del proceso de elaboración (materias primas y productos en proceso), que permiten adoptar medidas preventivas y/o correctoras en los procesados que eviten la acumulación de micotoxinas en los productos acabados.
